细胞复苏的步骤

细胞复苏讲究“快融”，越快融化，细胞所受损伤就越小。细胞复苏的操作不复杂，但每一步都必须稳扎稳打，才能最大限度地提高复苏存活率。

细胞复苏步骤

步骤1：水浴锅预热至37℃备用

步骤2：准备15mL离心管，并向其中加入适量培养基待用

小贴士：离心管中加入4.5~9mL的培养基，比较难养的细胞，可适量增加培养基。

步骤3：将细胞冻存管从-80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中，迅速投入水浴锅

小贴士：如果冰箱或液氮距离水浴锅路途较远（步行超过1min），要把细胞先置于干冰上，再送至水浴锅。如果将细胞冻存管直接放在手上或口袋里，可能导致温度逐渐回升而产生冰晶损伤细胞。而将细胞冻存管装在PE手套中，是为了预防污染。

步骤4：用力摇晃冻存管，使其在1分钟内融化

小贴士：这一步越快融化越好，最好能放计时器在旁边。如果1分钟内没有融化，可能是冻存液量偏多，或者摇晃力度不够。

步骤5：用纸巾擦拭水渍，转移至生物安全柜。用移液枪吸取细胞悬液，缓慢滴加到步骤2中准备好的离心管

小贴士：当同时复苏多管细胞时，注意不要弄混。

步骤6：1200rpm离心3分钟

小贴士：离心是为了去除DMSO，对于DMSO敏感的细胞，必须离心；若复苏的细胞对DMSO不敏感，步骤6、步骤7可以省略，直接将培养基补足至10mL，接种至培养器皿中，第二天换液。

步骤7：弃上清，用新鲜培养基重悬细胞，接种至新的无菌培养器皿中

细胞复苏操作示意图

做完步骤7，细胞就复苏好了。复苏的细胞需要一段时间恢复状态，当复苏后的细胞密度低于80%时，48小时内不要换液，待细胞形态、生长速度等恢复正常，再进行细胞传代等操作。（不要因为复苏后两三天细胞状态不好就丢弃，应耐心等待至少一周。）

当然，细胞复苏后状态很好的情况下，可以提前开始后续的细胞培养实验。